Тема: Влияние гуминовых кислот как стимуляторов роста растений на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro

  • Вид работы: Диплом
  • Предмет: Биология

Содержание


Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общие сведения о культуре ткани высших растений

1.2 Культура ткани в размножении пшеницы

1.3 Гормональная регуляция в культуре ткани

Общие сведения о влиянии гормонов

Гуминовые кислоты

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Описание объекта

2.2 Получение стерильных растений пшеницы in vitro

2.3 Определение сахаров методом Дюбуа

2.4 Выделение суммарных белков

2.5 Спектрофотометрический метод определения содержания зеленых пигментов

Глава 3. Результаты и обсуждение

Выводы

Список литературы

Summary

Приложения

Введение


Пшеница является главной сельскохозяйственной культурой для большинства населения умеренной климатической зоны.

Перспективы дальнейшего роста в растениеводстве связывают с рядом новых факторов, в частности с широким использованием методов культуры ткани и органов. Для успешной пролиферации растительных тканей in vitro в большинстве случаев необходимы экзогенные регуляторы роста (фитогормоны). При культивировании клеток растений чаще всего используются вещества, принадлежащие к двум типам фитогормонов: ауксины, способствующие увеличению размеров клеток, и цитокинины, вызывающие их деление [9, 16, 17, 22, 23].

Типичная схема гормонального контроля органогенеза описана Скугом и Миллером [30] на примере каллуса табака: образование побегов стимулируется при условии преобладания концентрации цитокинина по отношению к ауксину, тогда как обратное соотношение способствует образованию корней. Эта модель приемлема для большинства видов растений; при этом концентрации гормонов широко варьируют и для каждого вида или сорта определяются эмпирически [2]. Но существуют и другие регуляторы роста, которые могут влиять на морфогенез. В настоящее время применяются различные стимуляторы роста, полученные на основе гуминовых кислот торфа. Запатентовано несколько способов использования тритерпеновых кислот для выращивания риса, томатов, картофеля и овощных культур. Известно, что гуминовые вещества торфа и тритерпеновые кислоты пихты обладают выраженной биологической активностью по отношению к растениям.

Цель исследования: Определить влияние гуминовых кислот как стимуляторов роста растений на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.

Задачи:

1.Получить стерильную культуру растений пшеницы сорта Черемшанка.

.Определить содержание гуминовых кислот в экстрактах, полученных из отработанного компоста после выращивания грибов (Agaricus bisporus).

3.Изучить влияние экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата на ростовые показатели растений пшеницы.

.Изучить влияние экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата на содержание белков и углеводов в тканях растений пшеницы в начальный период роста.

Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ под руководством доктора биологических наук, профессора Н.А. Гаевского.

Глава 1. Обзор литературы


1.1 Общие сведения о культуре ткани высших растений


Под термином "культура тканей и клеток растений" понимают выращивание in vitro изолированной клетки, ее отдельных структур, различных тканей, частей и органов растений в стерильных условиях на искусственных питательных средах. Метод культуры клеток и тканей растений основан на уникальном свойстве растительных клеток - тотипотентности. Согласно этому свойству, любая, даже высокоспециализированная клетка содержит полный объем генетической информации о структуре и функциях целого организма [11]. А потому, из одной клетки, путем дифференциации можно получить полноценное растение - регенерант. Дедифференциация составляет физиологическую основу культуры ткани высших растений, так как введение ткани в культуру означает, прежде всего, то, что произошло индуцирование клеточных делений в тканях различной степени дифференциации. Получением целого растения - регенеранта в культуре ткани цикл клеточных превращений замыкается. При выборе материала предпочтение отдают меристематическим тканям и органам, поскольку их клетки активно делятся и удобны для культивирования, легче выживают в культуре, обладают большей скоростью роста, в большей степени проявляют тотипотентность. Значительно труднее создать контролируемые условия для выращивания дифференцированных тканей, закончивших рост, а также яйцеклеток, зиготы, зародышей, ранних этапов эмбриогенеза. Регенерацию растений из культуры тканей можно достичь, используя один из трех методов: культуру зародышей, соматический эмбриогенез и органогенез. Культура зародышей - представляет собой стерильную культуру зиготических зародышей. Развитие и прорастание зародыша происходит на питательной среде так же, как это было и в семени [3].

Другой механизм образования регенерантов - через соматический эмбриогенез. Соматический или неполовой эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышевых структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой происходит. В дальнейшем такие зародыши развиваются и прорастают в регенеранты через стадии, тем, что встречаются при развитии зиготы [39].

Формирование растений in vitro путем органогенеза состоит в появлении и росте побегов, корней или других органов из культивируемых клеток растений. Для регенерации целого растения таким способом обычно вызывают формирование побегов in vitro. Полученные побеги переносят на среду для укоренения. В результате образуется растение - регенерант. Опыт экспериментальной и практической работы показывает, что генетически наиболее стабильны организованные меристемы. Поэтому, регенерация растений через развитие побегов из пазушных почек является основой для промышленного клонального размножения многих растений [3]. Для получения культивируемых in vitro тканей и регенерантных растений различными исследователями были разработаны и предложены 10 разнообразных питательных сред - Уайта [53], Готре [36], Нича [47], Мурасиге и Скуга [45], Хеллера [38], Гамборга [35] и др.


.2 Культура ткани в размножении пшеницы


Открытие андрогенеза in vitro у растений [37, 40] - образования растения-регенеранта из микроспоры, можно охарактеризовать как одно из самых значительных в биологии растений за последние 35 лет. Данный феномен лег в основу метода культуры изолированных пыльников и микроспор [43]. К настоящему времени накоплен значительный эмпирический материал по изучению различных аспектов андрогенеза in vitro. Разрабатываются и эмбриологические основы этого интереснейшего феномена. Привлечение эмбриологической информации в данном случае совершенно необходимо. В сфере внимания именно эмбриологии находятся проблемы индивидуального развития растительного организма, познания сущности и причин происходящих при этом формообразовательных процессов как in vivo, так и in vitro [15, 20, 41].

Различают два пути морфогенеза в культуре пыльников злаков [21]: эмбриоидогенез (растение - регенерант возникает из микроспоры через формирование эмбриоида - зародышеподобной структуры) и каллусогенез (микроспора сначала формирует недифференцированный каллус, который дает начало растению - регенеранту после переноса на среду, индуцирующую органогенез).

Начальное звено любого морфогенеза - инициальная клетка. В случае андрогенеза in vitro речь должна идти о микроспоре - клетке, в условиях культуры дающей начало морфогенным структурам (эмбриоидам и каллусам) [42].

С эмбриологических позиций проблема образования морфогенных структур в культивируемых пыльниках связана с решением проблемы "переключения" развития микроспоры с обычного для нее гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития [44].

Уже на ранних этапах работы по изучению андрогенеза in vitro возникло представление о существовании в пыльниках особой фракции морфогенетически компетентных микроспор, способных развиваться по спорофитному пути [50]. Вопрос о том, приобретается ли компетентность к спорофитному развитию только в условиях in vitro или морфологическим эквивалентом компетентных микроспор являются различного рода аномальные микроспоры, уже присутствующие в пыльниках in vivo, до культивирования, пока не решен однозначно, хотя имеется немало данных в пользу именно последнего предположения [19].

К настоящему моменту исследователи не пришли к единому мнению о фазе развития микроспор, адекватной для начала культивирования пыльников. Согласно данным большинства исследователей, оптимальной для индукции андрогенеза in vitro у злаков (в частности, пшеницы) является сильновакуолизированная фаза развития микроспор. Однако ряд исследователей сообщают об иных фазах микроспорогенеза, оказавшихся благоприятными для индукции андрогенеза in vitro у тех или иных видов злаков. Таким образом, данный вопрос остается дискуссионным [20].

Многолетние разносторонние исследования морфогенеза интактных растений позволили установить, что процесс образования новой формы есть результат координированного действия активной пролиферации, роста и дифференциации клеток в очагах органогенеза, и на ультраструктурном уровне частот определяется динамическими перестройками тубулинового и актинового цитоскелетов. Формообразование, как органов побега, так и корневой системы у растения начинается с активации делений клеток в определенной плоскости. То есть на молекулярном уровне морфогенез, по-видимому, сопряжен с активностью пролиферации [52]. Несмотря на общий генотип донорного растения и взятого от него экспланта, закономерности морфогенеза, характерные для интактного растения, могут нарушаться в специфичных условиях культивирования in vitro. Соотношение активности пролиферации неорганизованной массы каллусных клеток и частоты морфогенеза практически не изучалось. В частности, для каллусных культур пшеницы такие данные редки и противоречивы. В одних работах указывается, что эмбриогенный каллус работает быстрее, чем неэмбриогенный, в других - что активность пролиферации и частота морфогенеза коррелируют не всегда. То есть вопрос о необходимости сопряжения генетических механизмов пролиферации и морфогенеза в культурах in vitro, например, у злаков, остается открытым [33].

Исследования частот каллусогенеза в течение ряда лет показало, что данный этап в каллусных культурах пшеницы протекает однотипно у всех изученных сортов. Экспланты полностью завершали каллусогенез к 14 - му дню культивирования. Экспланты, не образовавшие каллус к этому дню были нежизнеспособными. Частоты каллусогенеза были стабильно высокими на протяжении трех лет исследований. Достоверных различий по частоте каллусогенеза между различными сортами не было выявлено [27].


1.3 Гормональная регуляция в культуре ткани


Общие сведения о влиянии гормонов

Исследования гормональной регуляции жизни растений является одной из центральных задач мировой физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. Это объясняется тем, что вся жизнь растительных организмов, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и кончая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Кроме того, фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия и в формировании устойчивости растений к экстремальным условиям [1].

Химическая основа действия фитогормонов в растительных клетках еще недостаточно изучена. В настоящее время полагают, что одна из точек приложения их действия близка к гену и гормоны стимулируют здесь образование специфичной информационной РНК. Эта РНК, в свою очередь, участвует в качестве посредника в синтезе специфичных ферментов - соединений белковой природы, контролирующих биохимические и физиологические процессы [26, 31].

В настоящее время активно исследуются следующие группы фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. Кроме того, в последнее время в растениях открыты также стероидные гормоны, салициловая и жасминовые кислоты, отвечающие всем критериям фитогормонов [24, 29].

Все фитогормоны объединяют некоторые общие свойства: они синтезируются в самом растении и являются высокоэффективными регуляторами физиологических программ. Их действие проявляется в крайне низких концентрациях (10-5 - 10-12 М) ввиду исключительно высокой чувствительности к ним растительных клеток. С помощью фитогормонов одни типы клеток и тканей растений регулируют физиологические процессы в других типах клеток и тканей [14].

К числу физиологических программ, регулируемых фитогормонами, относится развитие и созревание семян, их прорастание, рост и морфогенез растений, переход растений к цветению, плодоношение, старение растений, опадение листьев, покой клубней, почек, семян и многое другое [6].

В последние годы наука достигла больших успехов в понимании того, как гормоны регулируют жизнь растений, вызывая переключение генетических программ, определяющих последовательность этапов развития, а также ответ растений на внешние воздействия [11]. Постулировано общее свойство классических фитогормонов: синтезируясь в одних частях растения и транспортируясь в другие его части, они оказывают влияние на многие процессы, в том числе морфогенетического характера. Установлено, что между фитогормонами существуют многообразные связи [18, 32]. Действие всех фитогормонов на растение весьма поливалентно: все они действуют на рост и деление клеток, на процессы старения и адаптации, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белков и на многие другие процессы. Показано, что существенными факторами для эффективного действия гормонов являются, с одной стороны, концентрация гормона, достигшего специфических клеток - "мишеней", с другой - компетентность растительных тканей [28, 29]. Все, что известно сегодня о механизме действия фитогормонов, крайне важно для того, чтобы понять, как происходит рост и развитие растений, то есть как реализуется их онтогенетическая программа, а также как растение реагирует на стрессы в течение своей жизни. Эти знания крайне важны для решения практических задач сельского хозяйства и биотехнологии, то есть для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях [4, 13].

Гуминовые кислоты

Гуминовые кислоты - органические вещества, извлекаемые из природных продуктов (торф, бурый уголь, каменный уголь) водными растворами щелочей. Сложная смесь соединений разного состава, свойств и строения, переходящая в воду из природных продуктов, таких как торф, бурый уголь, каменный уголь. Гуминовые кислоты влияют на органолептические свойства воды (запах, цвет), ускоряют коррозию металла, оказывают отрицательное влияние на развитие водных микроорганизмов, влияют на химический состав воды (снижают содержание кислорода, влияют на ионные и фазовые равновесия). При нейтрализации образующихся при этом растворов солей (гуматов) гуминовые кислоты выпадают в виде темноокрашенного объемистого осадка. Из осадка могут быть выделены фульвокислоты, которые переходят в водный раствор после его подкисления (15% в торфах и до 45% в окисленных углях).

По химической структуре гуминовые кислоты - высокомолекулярные конденсированные ароматические соединения (молекулярная масса = 1300-1500), в которых установлено наличие фенольных гидроксилов, карбоксильных, карбонильных и ацетогрупп, простых эфирных связей и др. Элементный состав: углерод - 50-70%, водород - 4-6%, кислород - 25-35%, азот - 3-5%. Обязательно входят сера - 0,7 - 1,2% и фосфор - 0,5%. Всегда есть разные металлы, хотя трудно сказать, обязательны ли они для гуминовых веществ или просто являются примесью, поскольку очистить гуминовые вещества нелегко.

Гуминовые субстанции, как органические компоненты индивидуальной природы, ускоряют превращение различных микроэлементов в формы непосредственно доступные растениям.

На сегодняшний день доступно множество исследований, в которых показана возможность реакций ауксинового типа в присутствии гуминовых субстанций. Кроме того, в нескольких работах четко установлено, что гуминовые субстанции увеличивают степень прорастания семян и увеличивают содержание витаминов в растениях [51].

Лиеске [54] сообщает, что гуминовые кислоты и их производные увеличивают проницаемость клеточных мембран в растении, увеличивая тем самым способность вбирать питательные вещества. Многими учеными был обнаружен положительный эффект оказываемый гуминовыми кислотами на размножение различных групп микроорганизмов. Они приписывают это свойство железу, которое присутствует в гуминовых кислотах или их коллоидной природе, кроме того, не исключается возможность того, что гуминовые субстанции являются органическими катализаторами [5].

Гуминовые кислоты в небольших количествах действуют как специфические сенсибилизирующие агенты, увеличивающие проницаемость плазмы, что приводит к увеличенному забору питательных веществ растениями. В больших объемах гуминовые кислоты являются источником доступного железа [46].

В последнее время вышло много работ, в которых продемонстрирован положительный эффект оказываемый гуминовыми кислотами на растения. Это влияние хорошо заметно как во внешнем виде растений, так и во внутренних биохимических процессах. Необходимо провести дополнительные исследования, для того, чтобы установить, каким образом производить и применять гуминовые удобрения. Основные принципы, полученные из теоретических аргументов, следующие: наличие в удобрениях субстанций хиноидной природы оказывает стимулирующее влияние на растения; способность гуминовых субстанций к мелкодисперсной растворимости в воде приводит к повышенной способности их проникновения в растения. Небольшие количества гуминовых удобрений не могут использоваться в качестве основного удобрения, они оказывают стимулирующий эффект только в том случае, когда присутствует необходимое количество основных питательных элементов, азота, фосфора и калия [12].

Интерес к применению различных органических удобрений продолжает увеличиваться. Очевидно, это вызвано следующими причинами:

Интерес в уменьшении применения минеральных удобрений;

Общественная обеспокоенность тем фактом, что химическая промышленность очень сильно загрязняет окружающую среду;

Увеличивающаяся необходимость в консервировании энергии.

Механизм формирования угля через стадию торфа обычно объясняется следующим образом: сначала торф превращается в лигнит, затем в смолистый уголь и наконец в антрацит. Происходит все это при высоких температурах, которые приводят к фракционной дистилляции. Коричневый уголь или, как его еще называют, лигнит сильно варьирует как по своим физико-химическим свойствам, так и по наличию различных гуминовых кислот, в зависимости от места залегания. Изучение химических процессов вовлеченных в формирование угля привело к различным гипотезам рассматривающим "гуминовые кислоты", "ульминовые кислоты", "гумины", "ульмины" и "фульвокислоты". Сейчас принято считать, что микроорганизмы отыграли решающую роль при формировании угля [51].

Количество органического вещества необходимого для внесения в почву было установлено уже давно. Однако химия и основы органического вещества стали предметом науки в 18 столетии. До Либиха считали, что гумус используется растениями непосредственно, но, после того как он показал, что рост растений зависит от неорганических компонентов, многие почвоведы стали считать удобрение органикой полезным только в случае полного разложения последней в неорганические формы.

В то же время многие из почвоведов придерживались мнения о том, что основное влияние гумуса на растения проявляется благодаря его повышенной способности удерживать влагу в почве. Затем в нескольких научных работах было показано, что растения способны абсорбировать комплексные органические молекулы системных инсектицидов, после этого уже никто не сомневался в способности растений абсорбировать растворимые формы гумуса.

Из гумусной золи, гуминовая фракция вытягивается кислотой, которая оставляет желтый осадок на поверхности. Последний представляет из себя фульво-фракцию. Ульминовой кислотой называется фракция гумуса, которую можно извлечь алкалоидом [46].

Недавние исследования, проведенные при помощи хроматографических, спектрофотометрических и рентгеновских методов многое прояснили в строении органических веществ, присутствующих в гумусе. Интенсивно исследовались реакции катионного и анионного обменов. Однако очень мало внимания уделялось изучению связей между химией и атрибутами почвенного плодородия: буферизации, образованию питательных элементов и гормональным эффектам из того же источника.

Гуминовые кислоты являются коллоидами и ведут себя подобно глине, но принято считать, что они кислоты, и образуют настоящие соли. Когда в гуминовой молекуле преобладают ионы водорода, материал предполагается кислотой и называется соответственно. Однако особого влияния на уровень рН не оказывается, поскольку эти кислоты нерастворимы в воде. Когда в молекуле преобладают катионы, отличающиеся от водорода, материал называют гуматом. Гуматы моновалентных щелочных металлов растворимы в воде, мультивалентные нерастворимы. Различные катионы оказывают малозаметное влияние на гуминовые молекулы, в смысле их растворимости и способности абсорбироваться в глинах [5].

В последние годы ученые выявили общие биохимические и экологические функции гуминовых веществ и их влияние на развитие растений. Среди важнейших можно выделить следующие:

·Аккумулятивная - способность гуминовых веществ накапливать долгосрочные запасы всех элементов питания, углеводов, аминокислот в различных средах;

гормональный гуминовая кислота пшеница

·Транспортная - образование комплексных органоминеральных соединений с металлами и микроэлементами, которые активно мигрируют в растения;

·Регуляторная - гуминовые вещества формируют окраску почвы и регулируют минеральное питание, катионный обмен, буферность и окислительно-восстановительные процессы в почве;

·Протекторная - путем сорбции токсичных веществ и радионуклидов гуминовые вещества предотвращают их поступление в растения.

Совмещение всех этих функций обеспечивает повышенные урожаи и необходимое качество с/х продукции. Особенно важно подчеркнуть положительный эффект от действия гуминовых веществ при неблагоприятных условиях воздействия среды: низкие и высокие температуры, недостаток влаги, засоление, скопление ядохимикатов и наличие радионуклидов. Неоспорима роль гуминовых веществ и как физиологически активных веществ. Они изменяют проницаемость клеточных мембран, повышают активность ферментов, стимулируют процессы дыхания, синтеза белков и углеводов. Они увеличивают содержание хлорофилла и продуктивность фотосинтеза, что в свою очередь создает предпосылки получения экологически чистой продукции. При сельскохозяйственном использовании земли необходимо постоянное пополнение гумуса в почве для поддержания необходимой концентрации гуминовых веществ [54].

До настоящего времени это пополнение осуществлялось в основном путем внесения компостов, навоза и торфа. Однако поскольку содержание собственно гуминовых веществ в них относительно невелико, то нормы их внесения очень велики. Это увеличивает транспортные и другие производственные издержки, которые многократно превышают стоимость самих удобрений. Кроме того, в них содержатся семена сорняков, а также болезнетворные бактерии (для навоза и компостов).

Для получения высоких и устойчивых урожаев недостаточно надеяться на биологические возможности сельскохозяйственных культур, которые, как известно, используются лишь на 10-20%. Конечно необходимо использовать высокоурожайные сорта, эффективные приемы агро - и фитотехники, удобрения, но уже нельзя обойтись и без регуляторов роста растений, которые к концу двадцатого века играют уже не менее важную роль, чем пестициды и удобрения [51].

Глава 2. Материалы и методы


2.1 Описание объекта


Пшеница (лат. Triticum) - род травянистых, в основном однолетних, растений семейства мятликовых, ведущая зерновая культура во многих странах, в том числе и России.

Корневая система мочковатая, колоски расположены колосом, по одному в каждом углублении его стержня. Колоски 2 - 5-цветковые; цветы тесно сближены, только нижние 1 - 3 плодущие, верхние мужские или неразвитые. Наружные колосковые чешуи (плёнки) парные, широкие, тупые, наверху с 1 зубцом или 1 или несколькими остями. Нижняя цветковая чешуя на спинке выпуклая, часто ладьеобразная, со многими жилками, на конце с 1 или несколькими зубцами или остями. Зерно с глубокой бороздкой, на вершине пушистое, свободное [48, 49].

Черемшанка - среднеранний сорт ценной яровой пшеницы с вегетационным периодом 76 - 85 дней. Урожайность - 45-50 ц/га. Масса 1000 зерен 32,0-35,0 г. Содержание белка - 15,2, а сырой клейковины - 31,0%. Высокие хлебопекарные качества. Сорт пригоден для лесостепной и степной зон Восточной Сибири. Включен в Госреестр по Восточно-Сибирскому региону с 1999 г как ценная пшеница. Стабильно формирует зерно высокого качества, обладает высокой устойчивостью к засухе, септориозу и поражению пыльной головней.


2.2 Получение стерильных растений пшеницы in vitro


Семена пшеницы сорта Черемшанка, помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому предварительно проводили поверхностную стерилизацию семян.

Для поверхностной стерилизации семян пшеницы сорта Черемшанка использовали следующие растворы: 3 % -ный раствор йода, 5 % -ный раствор гипохлорита Na. Затем экспланты промывались 3 раза по 15 мин. в стерильной дистиллированной воде и в стерильных условиях в ламинар-боксе семена помещали на агаризованную среду MS (таб.1) с добавлением гумата и др. В нашем случае использование белизны оказалось более приемлемым, так как процент заражения составлял 1 %, при этом в остальных случаях либо был большой процент заражения, либо большой отпад эксплантов.

Затем в стерильных условиях ламинар - бокса экспланты переносили на питательную среду и выращивали в условиях светокультуры при температуре 25-26 0С, освещенностью 5 тыс. лк при 16-часовом фотопериоде.


Таблица 1.

Состав среды MS

№ п. п. Компонент средыКоличество вещества Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора) 1. 2. 3. 4. KNO3 NH43 KH2PO4 MgSO4.7H2O 1,9 1,65 0,17 0,37 5. CaCl2 безводный0,44Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора) 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O KJ CoCl2.6H2O0,25 0,025 6,2 22,3 8,6 0,83 2,5Витамины13. 14. 15. 16. 17. 18. Никотиновая кислота Пиридоксин HCL Тиамин HCL Fe-хеллат Мезоинозит Сахароза1 1 1 5 100 мг/л 30

2.3 Определение сахаров методом Дюбуа


Количество углеводов определяли в этанольных экстрактах модифицированным методом Дюбуа [34].

Навеску растительного материала измельчали, фиксировали 96 % спиртом (десятикратным количеством). Фиксированный материал тщательно растирали в ступке и экстрагировали из него сахара пятью миллилитрами 80% этанола, нагретого до 70°С. Экстракт вместе с растительными остатками помещали в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 5 минут при 5000 оборотах/мин. Надосадочную жидкость сливали в мерную колбу на 25 мл, так чтобы не попали растительные остатки. К осадку, который остался в центрифужных стаканах, приливали 5 мл 80% этанола (нагретого), тщательно перемешивали и вновь центрифугировали. Данную операцию повторяли 5-6 раз, до полного извлечения сахаров и доведения до метки.

Брали вытяжку сахара (1 мл) и разбавляли 1 мл спирта (80% нагретого).

Из полученного соотношения вливали в пробирку 1 мл 5% фенола (свежеприготовленного). И осторожно в центр пробирки приливали 2 мл Н2SO4 концентрированной. Через 30 минут определяли оптическую плотность при 440 нм.

Содержание сахаров рассчитывается по заранее построенным калибровочным кривым, для которых используют стандартные растворы сахаров. Калибровочная кривая состоит из смеси глюкозы, фруктозы и сахарозы в соотношении 1: 1: 1.

2.4 Выделение суммарных белков


Для выделения всех белковых веществ использовали щелочные растворы, в которых большинство белков довольно хорошо растворяются.

Для извлечения белков из свежего растительного материала навеску листьев, стеблей промораживали в холодильнике (1 сутки). Затем измельчали в гомогенизаторе или растирали с четырехкратным (по массе) количеством буфера (рН=10,0). Гомогенат промораживали в холодильнике, и, после оттаивания, встряхивали на механической мешалке в течение 1-2 часов, затем центрифугировали в течение 5-10 минут при 3000 об/мин. Жидкость над осадком сливали, а остатки клеток вновь гомогенизировали или растирали в ступке с прокаленным песком. Затем гомогенат снова встряхивали с буферным раствором в течение 20-30 минут и опять центрифугировали. Такую экстракцию проводили 5-6 раз. Общий объем экстракта доводили буферным раствором до 25 мл [7].

Боратный буфер (рН=10,0):

Раствор 5: NaOH 0,1Н

Раствор 8: тетроборат Na 0,05М (12,367 г Н3ВО3 + 100 мл 1Н раствора NaOH в 1 л).41 мл раствора 5 доводили до 100 мл раствором 8.

Определение содержания белка по биуретовой реакции [10].

Биуретовый реактив: растворяли в 250 мл воды 0,75 г CuSO4·5H2O и 3 г виннокислого натрия-калия (NaKC4H4O6·4H2O), затем при энергичном помешивании добавляли 150 мл 10 % -го раствора NaOH, свободного от Na2CO3, и 1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления; объем раствора довели водой до 1 л.

К 1мл исследуемого раствора, содержащего 1-10 мг белка, прибавляли 4 мл биуретового реактива, перемешивали и оставляли стоять 30 минут при комнатной температуре. По истечении времени колориметрировали при ?=540 нм против воды. Содержание белка рассчитывали по калибровочной кривой, составленной для альбумина: в серию пробирок вливали 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мл 1 % -го водного раствора яичного альбумина, содержащего от 1 до 10 мг белка, доводили объем раствора дистиллированной водой до 1 мл, перемешивали, добавляли в каждую пробирку по 4 мл биуретового реактива, перемешивали и через 30 минут колориметрировали.


2.5 Спектрофотометрический метод определения содержания зеленых пигментов


Содержание зеленых пигментов определяли спектрофотометрическим методом по молярным коэффициентам экстинции.

Для этого, определенную навеску сырого растительного материала заливали 5 мл.96% этанола и ставили на водяную баню (t=70 ºC) на 30 минут. После бани, полученный раствор помещали в холодильник на ночь для получения более полной экстракции хлорофилла [8].

Определение оптической плотности экстракта осуществляли на спектрофотометре (СФ-16), обладающем достаточной разрешающей способностью. Для вычисления концентрации пигментов, использовали формулы:


Ca = [13,7× (D665-D750) - 5.7× (D649 - D750)] ×V/m

Cb= [25.8× (D649-D750) - 7.6× (D665 - D750)] ×V/m,


где концентрации Са - концентрация хлорофилла а (мкг/мл), Сb - концентрация хлорофилла b (мкг/мл), D - оптическая плотность раствора при заданной длине волны, V - обьем навески (мл), m - масса навески (мкг) [25].

Глава 3. Результаты и обсуждение


Для построения калибровочных графиков измеряли оптическую плотность гуминовых кислот. Для этого брали 1 г коммерческого гумата "Гумат+С" (г. Иркутск), растворяли в 200 мл дистиллированной воды. Готовили ряд разведений, на основе которых строили калибровочный график при длинах волн 440 нм и 490 нм.


Рис.1. Калибровочный график измерения оптической плотности при длине волны 440


Рис.2. Калибровочный график измерения оптической плотности при длине волны 490


График показывает, что рабочий диапазон позволяет определить концентрацию гумата в пределах от 0 до 0,16 г/л.

Для извлечения гуминовых кислот из отработанного компоста после выращивания грибов (Agaricus bisporus) навеску 1 г растворяли либо в 50 мл 0.1 н раствора NaOH, либо в 50 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводили на водяной бане в течение 1 часа. Суспензию центрифугировали при 5000 оборотах в течение 15 минут. Гомогенат анализировали на ФЭКе при длинах волн 440 нм и 490 нм.

Проростки растений, в зависимости от срока выращивания и концентрации гумата, даны в приложении.

Ростовые показатели растений представлены на рис.3 и рис.4


Рис.3. Общая масса растений пшеницы


Рис.4. Масса надземной части растений пшеницы


На рис.3 и рис.4 видно, что наибольшая масса растений пшеницы на 45 сутки вегетации, а наименьшая - на 14 сутки. За исключением растений, выращенных на среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л) и водного экстракта гумата (0,2 г/л), у которых наибольшая масса на 43 сутки вегетации, а также исключения составляют растения, выращенные на среде с добавлением щелочного экстракта гумата (0,1 г/л), у которых на 34 сутки самая большая масса.

Статистический анализ достоверности различий общей массы растений показал, что между концентрациями одного варианта достоверно проявляются различия у растений, выращенных на питательной среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 14 сутки культивирования, а различия по качеству источника гумата достоверны между растениями, выращенными на питательных средах с добавлением коммерческого препарата (0,2 г/л) и щелочного экстракта гумата (0,2 г/л) на 14 сутки культивирования, а так же щелочного экстракта гумата (0,1 г/л) и водного экстракта гумата (0,2 г/л) на 45 сутки культивирования.

Достоверностью различий надземной массы растений между концентрациями одного варианта являются растения, выращенные на среде, с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 14 сутки культивирования, а по качеству источника гумата достоверны различия у растений, выращенных на средах с добавлением щелочной экстракции гумата (0,1 г/л) и коммерческого препарата (0,1 г/л и 0,2 г/л).

Содержание хлорофилла в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред показано на рис.5 и рис.6, а так же в табл.2 и табл.3


Рис.5. Содержание хлорофилла а


На рис.5 видно, что в растениях, выращенных на питательной среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л) с течением времени повышается количество хлорофилла а, в отличие от растений, выращенных на среде с добавлением коммерческого препарата гумата (0,2 г/л), где количество хлорофилла а сначала увеличивается (14 и 34 сутки), а потом (43 сутки) резко уменьшается. У растений, выращенных на остальных питательных средах с гуматом, сначала понижается содержание хлорофилла а (14 и 34 сутки), а потом, на 43 сутки, количество хлорофилла увеличивается.

Статистический анализ достоверности различий содержания хлорофилла а между концентрациями одного варианта показал, что различия достоверно проявляются у растений, выращенных на питательной среде с добавлением щелочной экстракции гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 34 сутки культивирования, коммерческого препарата гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 34 сутки культивирования и коммерческого препарата гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 43 сутки культивирования.

По качеству источника гумата достоверных различий не отмечено.


Рис.6. Содержание хлорофилла b


На рис.6 видно, что на 34 сутки эксперимента содержание хлорофилла b практически одинаково, а на 14 сутки наибольшее содержание хлорофилла b у растений, выращенных на питательной среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л). На 43 сутки вегетации увеличилось количество хлорофилла по сравнению с 14 и 34 сутками только у растений, выращенных на среде с добавлением щелочного экстракта гумата (0,2 г/л). В остальных случаях содержание хлорофилла b наиболее высокое на 14 сутки вегетации, и на 34 сутки вегетации - у растений, выращенных на среде с добавлением коммерческого препарата гумата (0,2 г/л).


Таблица 2.

Содержание хлорофилла в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред

Дата, сроки культивированияГуминовые кислотыОбщее содержание хл. амкг/г. сыр. мОбщее содержание хл. вмкг/г. сыр. мПолученыизКонцентрация, г/л29.04.2008 14 днейВодный экстракт0,1703,80±48,81321,38±24,09Водный экстракт0,2647,62±56,57148,32±13,46Щелочной экстракт0,1777,95±63,31179,84±19,44Щелочной экстракт0,2771,79±73,23182,35±15,59Коммерческий препарат0,1649,28±18,73199,39±32,51Коммерческий препарат0,2657,69±112,42109,64±53,2619.05.2008 34 дняВодный экстракт0,1792,65±105,06145,49±18,65Водный экстракт0,2511,64±148,99131,51±22,68Щелочной экстракт0,1500,22±38,08129,28±10,46Щелочной экстракт0,2771,79±73,23182,35±15,59Коммерческий препарат0,1444,47±113,31124,89±24,68Коммерческий препарат0,2782,52±71,32183,76±15,16

Таблица 3.

Содержание хлорофилла в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред

Дата,сроки культивированияГуминовые кислотыОбщее содержание хл. амкг/г. сыр. мОбщее содержание хл. вмкг/г. сыр. мПолученыизконцентрация, г/л28.05.2008 43 дняВодный экстракт0,1484,66±347,31172,58±114,49Водный экстракт0,2643,89±147,1668,01±15,48Щелочной экстракт0,1768,54±455,29133,99±20,89Щелочной экстракт0,2669,74±194,13226,39±62,87Коммерческий препарат0,1501,40±64,79160,56±69,17Коммерческий препарат0,2266,76±66,39170,60±12,98

Статистический анализ достоверности различий содержания хлорофилла b между концентрациями одного варианта показал, что различия достоверно проявляются у растений, выращенных на питательной среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 14 сутки культивирования и щелочного экстракта гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л) на 34 сутки.

По качеству источника гумата достоверны различия хлорофилла b у растений, выращенных на средах с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л) и коммерческого препарата (0,2 г/л).

Содержание сахаров в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред показано на рис.7, а также в табл.4


Рис.7. Количественное содержание сахаров.


На рис.7 видно в питательной среде с водного экстракта гумата (0,1 г/л) содержание сахаров в биомассе пшеницы уменьшилось к 45 суткам вегетации.

В питательной среде с водным экстрактом гумата (0,2 г/л) Содержание сахара наиболее велико на 34 сутки, а на 14 и 45-е количество сахаров одинаково.

В среде с добавлением щелочного экстракта гумата (0,1 г/л) резкое увеличение содержания сахаров происходит на 45 сутки вегетации, а наиболее низкое на 34-е.

В среде с добавлением щелочного экстракта гумата (0,2 г/л) наибольшее содержание сахара на 45 сутки, а наименьшее на 34-е, но разница незначительная.

В питательной среде с добавлением коммерческого препарата гумата (0,1 г/л) заметное снижение количества сахаров происходит на 34 сутки.

В питательной среде с добавлением коммерческого препарата гумата (0,2 г/л) снижение сахаров происходит на 45 сутки вегетации, на 14 и 34 сутки содержание примерно одинаково.


Таблица 4.

Содержание сахаров в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред

Дата, сроки культивированияГуминовые кислотыОбщее содержание сахаров, мг/г. сыр. мполучены изконцентрация, г/л29.04.2008 14 днейВодный экстракт0,123,4±0,49Водный экстракт0,225,2±1,49Щелочной экстракт0,126,3±2,28Щелочной экстракт0,222,4±1,24Коммерческий препарат0,124,4±0,67Коммерческий препарат0,224,3±1,2619.05.2008 34 дняВодный экстракт0,121,4±4,52Водный экстракт0,226,7±4,49Щелочной экстракт0,118,1±0,89Щелочной экстракт0,218,8±2,68Коммерческий препарат0,111,6±1,74Коммерческий препарат0,225,4±5,3930.05.2008 45 днейВодный экстракт0,111,2±2,47Водный экстракт0,224,9±6,55Щелочной экстракт0,144,1±11,04Щелочной экстракт0,225,2±5,98Коммерческий препарат0,123,5±2,16Коммерческий препарат0,214,3±5,11

Статистический анализ достоверности различий содержания сахаров по качеству источника гумата показал, что различия достоверно проявляются у растений, выращенных на питательных средах с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л) и коммерческого препарата (0,1 г/л) на 34 сутки культивирования, а также с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л) и щелочного экстракта гумата (0,1 г/л) на 45 сутки культивирования.

Содержание белков в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред показано на рис.8 и в табл.5


Рис.8. Количественное содержание белков.


На рис.8 видно, что резкое увеличение количества белка на 41 сутки вегетации, по сравнению с 35 произошло в пшенице, выращенной на питательной среде с добавлением водного экстракта гумата (0,1 г/л). В растениях, выращенных на других питательных средах, наибольшее содержание белка наблюдается на 35 сутки вегетации, и наибольшее содержание белка наблюдается у растений, выращенных на среде с добавлением щелочного экстракта гумата (0,2 г/л).


Таблица 5.

Содержание белков в надземной части растений пшеницы в зависимости от состава питательных сред

Дата, сроки культивированияГуминовые кислотыМасса навески, гОбщее содержание белков, мг/г. сыр. мполучены изконцентрация, г/л20.05.2008 35 суткиВодный экстракт0,10,488,42Водный экстракт0,20,438,72Щелочной экстракт0,10,3110,75Щелочной экстракт0,20,2513Коммерческий препарат0,10,536,84Коммерческий препарат0,20,518,2526.05.2008 41 суткиВодный экстракт0,10,3313,13Водный экстракт0,20,546,71Щелочной экстракт0,10,566,4Щелочной экстракт0,20,389,21Коммерческий препарат0,10,66,88Коммерческий препарат0,20,467,25

Выводы


1.Стерильная культура растений пшеницы сорта Черемшанка получена на основе среды MS с добавлением стимуляторов роста - гуминовых кислот, в частности коммерческого препарата на основе отработанного компоста после выращивания грибов (Agaricus bisporus).

.Изучено влияние экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата на ростовые показатели растений пшеницы. Отмечен рост проростков на всех культурах. Темп роста не линейный.

3.Экстракты гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата влияют на содержание белков и углеводов в тканях растений пшеницы в начальный период роста.

На количество белка в большей степени влияет среда с добавлением водной экстракции гумата (0,1 г/л) на 45 сутки вегетации растения, и среда экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста с добавлением щелочной экстракции гумата (0,2 г/л) на 35 сутки вегетации. В растениях, выращенных на этих пиательных средах, содержится больше белка, чем в растениях, выращенных на других питательных средах.

Наибольшее количество сахаров содержалось в растениях как на 45 сутки вегетации, так и на 34-е. На 45 сутки вегетации наиболее велико содержание сахаров у растений, выращенных на средах с добавлением щелочной экстракции гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л), а на 34 сутки - водной экстракции гумата (0,2 г/л), коммерческого препарата гумата (0,1 г/л и 0,2 г/л).

Содержание хлорофилла а повышается к окончанию периода вегетации (на 43 сутки эксперимента) практически у всех растений, выращенных на средах с добавлением экстрактов гуминовых кислот, а хлорофилла b в пшенице содержится больше в основном на 14 сутки вегетации растений.

Список литературы


1.Араратян, Л.А. Цитогенетические эффекты фитогормонов. / Л.А. Араратян. - Ереван: АН Арм. ССР, 1989.137 с.

2.Баскаков, Ю.А. Регуляторы роста растений / Ю.А. Баскаков, А.А. Шаповалов. - М.: Знание. - 1982.64 с.

.Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко. - М.: ФБК - ПРЕСС. - 1999.159 с.

.Быков, О.Д. Физиология растений / О.Д. Быков // Физиология растений. - 1985. Т.32. - №3. С.421-430.

.Вахмистров, Д.Б. Поверхностная активность гуминовых кислот - одна из причин их стимулирующего действия на рост растений / Д.Б. Вахмистров, Н.Е. Мишуотина, О.А. Зверкова, Е.Ю. Дебец // Физиология растений. - 1989. Т.36. С.980-989.

.Ганева, Г. Физиологическая активность ауксинов в анеуплоидных линиях пшеницы / Г. Ганева, Е. Зозикова, А. Дрянова // Физиология растений. - 2000. Т.47. - №2. С.236-239.

.Голованова, Т.И. Физиология растений: малый практикум / Т.И. Голованова, А.Н. Бугакова. - Красноярск, 1983.30 с.

.Гольд, В.М. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла / В.М. Гольд, Н.А. Гаевский, Ю.С. Григорьев, В.А. Попельницкий // Красноярск: Изд-во КрасГУ. 1984. С.50-53.

.Дерфлинг, К. Гормоны растений. Системный подход / К. Дерфлинг. - М.: Мир. - 1985.304 с.

.Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. - М.: Мир. - 1991.544 с.

.Ежова, Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro Т.А. Ежова // Онтогенез. - 2003. Т.34. С.245-252.

.Ермаков, Е.И. Влияние гумусовых кислот на механические свойства клеточных стенок / Е.И. Ермаков, И.Н. Ктиторова, О.В. Скобелева // Физиология растений. - 2000. Т.47. - №4. С.591-599.

.Заленский, О.В. Физиология растений / О.В. Заленский // Физиология растений. Изв. АН СССР. - 1961. - Сер. Биол. №2.С. 202-212.

.Зауралов, О.А. Изменение содержания фитогормонов в листьях пшеницы при завядании / О.А. Зауралов, Т.Н. Пустовойтова, М.В. Чернавина // Физиология растений. - 1987. Т.34. Вып.3. С.564-568.

.Карабаев, М.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы. Морфогенез и толерантность/ М.К. Карабаев, Ж.К. Джардемалиев // Физиология растений. - 1994. Т.41. С.807 - 814.

.Кефели, В.И. Рост растений / В.И. Кефели - М.: Колос. - 1984.160 с.

.Кефели, В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны / В.И. Кефели. - М.: Наука. - 1974.200 с.

.Кефели, В.И. Физиология растений. / В.И. Кефели, Н.Г. Амрайн. - 1977. Т.24. Вып.1.120 с.

.Круглова, Н.Н. К изучению характера проявлений аномалий в процессе развития микроспор и пыльцевых зерен злаков / Н.Н. Круглова // Тез. докл. междунар. конф. "Молекулярная генетика и биотехнология". - Минск. - 1998.210 с.

.Круглова, Н.Н. Периодизация развития пыльника злаков как методологический аспект изучения андрогенеза in vitro / Н.Н. Круглова // Известия РАН. Серия биологическая. 1999. № 3. С.275-281.

.Круглова, Н.Н. Электронно-микроскопическое исследование морфогенной микроспоры пшеницы in vitro и зиготы in situ / Н.Н. Круглова // Цитология. - 1999. Т.41. - № 3-4.283 с.

.Мокроносов, А.Т. Рост растений и его регуляция / А.Т. Мокроносов. - Кишинев: Штиица. - 1985.185 с.

.Музафаров, Е.Н. Рост растений и его регуляция / Е.Н. Музафаров, Р.Х. Рузиева - Кишинев: Штиица. - 1985.212 с.

.Муромцев, Г.С. Состояние исследований по регуляторам роста растений в России / Г.С. Муромцев, Е. Данилина // Физиология растений. - 1994. Т.41. С.779-787.

.Нестеренко, Т.В. Термоиндукция флуоресценции хлорофилла и возрастное состояние листьев высших растений / Т.В. Нестеренко, В.Н. Шихов, А.А. Тихомиров // Физиология растений. - 2001. Т.48. С.282-290.

.Полевой, В.В. Фитогормоны. / В.В. Полевой. - ЛГУ. - 1982.248 с.

.Соболева, М.И. Статистические характеристики, маркирующие морфогенез в каллусных культурах яровой мягкой пшеницы / М.И. Соболева, И.В. Логинов // Физиология растений. - 2004. Т.51. - № 2. С.287 - 296.

.Тома, С.И. Рост растений и его регуляция (генетические и физиологические аспекты) / С.И. Тома. - Кишинев: Штиинца - 1985.222 с.

.Чайлахян, М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений / М.Х. Чайлахян // Успехи современной биологии. - 1982. Т.95. Вып.1. С.23-34.

.Чуб, В.В. Рост и развитие растений. / В.В. Чуб - М., 2003.

.Якушкина, Н.И. Физиология растений / Н.И. Якушкина. - М.: Просвещение. - 1993.335 с.

32.Azscon - Bieto, J. Plant Physiol. / J. Azscon - Bieto, B. Osmond. - 1983. №71. Р.574-581.

33.Beale, S. Plant Physiol. / S. Beale. - 1990. V.93. - №4. Р.1273-1279.

34.Dibois, M. Colometric method for determination of sugars and related substances / M. Dibois, K. A. Gilles, Y. K. Hamilton, P. A. Reber, F. Smith // Analit. Chem. 1956. Vol.28. P.350-356.

35.Gamborg, O. Culture methods and detections of glucanases in suspension cultures of wheat and parleys / O. Gamborg, D. Evelegh // Can. J. Biochem. - 1968. V.46. P.417-421.

36.Gautheret, R. La culture des tissues vegetaux / R. Gautheret. - Paris. - 1959.864 p.

37.Guha, S. In vitro production of embryos from anther of Datura / S. Guha, S. Maheshwari // Nature. 1964, V. 204. - № 4957.497 p.

38.Heller, R. Recherches sur la nutrition minerale des tissues vegetaux cultives in vitro / R. Heller // Bot. biol. et veget. t.14. P.1-223.

39.Kamada, H. Physiological and molecular biological studies on somatic embryogenesis / H. Kamada. // Chem. Reg. Plants. 1996.31: 1-11.

40.Kruglova, N. N. Androgenesis in vitro and amphimixis: comparative analysis of the early stages in wheat / N. N. Kruglova, V. Yu. Gorbunova // Proceed. XIV Intern. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Lorne. 1996.146 p.

.Kruglova, N. N.comparative ultrastructural analysis of the early stages of morphogenesis in vitro and morphogenesis in vivo in wheat / N. N. Kruglova - Тез. докл. междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. - СПб., 1997.355 c.

42.Kruglova, N. N. Cytological aspects of wheat anther culture / N. N. Kruglova, V. Yu. Gorbunova, N. N. Potapova // Proceed. XI Intern. Sympos. "Embryology and seed perpoduction". St. Petersburg. 1992. P.292-293.

43.Kruglova, N. N. Microspore as the initial cell of morphogenesis in wheat anther culture in vitro / N. N. Kruglova, V. Yu Gorbunova // Тез. докл. VII междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда".М., 1997.117 c.

44.Kruglova, N. N. Pollen embryoid and sexual embryo in wheat: similarity and difference / N. N. Kruglova, V. Yu Gorbunova // Proceed. XII Intern. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Ohio. 1992.36 p.

45.Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Scoog // Physiol plantarum. - 1962. V.15. P.473 - 497.

46.Muscolo, A. IAA Activity in Humic Matter / A. Muscolo, S. Nardi, S. Cutrupi // Plant Physiol. Biochem. 1996. Spec. Iss. P. 203-204.

47.Nitsch, J. La culture de pollen isole sur milien synthetique / J. Nitsch // Acad. Sci. Pans. - 1974.278. D. P.1031 - 1034.

48.Rosel, H. A. Plant physiol. / H. A. Rosel, A. N. Heber. - 1963. V.38. - №4. p.523.

49.Sharp, R. Plant Physiol. / R. Sharp, N. Matthews, J. Boyer. - 1984. №75. P.95-101.

50.Sunderland N. Anther and pollen culture / N. Sunderland // Proceed. IV John Innes Sympos. "The plant genome". Norwich. - 1980. P.171-183.

51.Serdyuk O. P. Phytomorfonal Activity of Humic Acids Isolated from Soil and Compost / O. P. Serdyuk, L. D. Smoligin, E. P. Ivanov, O. E. Trubetskay, A. Trubetskoy, R. Obertur // Dokl. Akad. Nauk. 1999. V.365. P.163-165.

52.Villar, R. Plant Physiol. / R. Villar, A. Held, J. Merino. - 1995. V.107. P.421-427.

53.White, Ph. Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artifician nutrient / Ph. White // Amer. j. Bot. - 1939. V.26. P.59 - 64.

.www.bioteh. biz.

Summary


The purpose of the work was to define the influence of humic acid as plant growth stimulators on the character of proteinaceous and carbohydrate metabolism on the wheat plants in vitro. Wheat plants of line Cheremshanka were the research objects.culture of the wheat plants was obtained based on MS media with adding of the humic acids, the plant growth stimulators. In this work was studied the influence of humic acids extracted from worked-out compost and commercial preparation on the plants growth. The mass of the wheat plants increased in this case. It was shown that content of chlorophyll a in the plants, grown on the media with adding of humic acid, increased to the end of the vegetation period. The content of chlorophyll b in the wheat plants was larger in the beginning of the vegetation.the 45th day of the vegetation the largest content of sugar was in the plants, grown on the medias with adding to humic acids the solution of NaOH (0,1) and NaOH (0,2), on the 34th day - the water solution of lignitic material (0,2) and dry lignitic material (0,1 and 0,2).a result it was determined that the largest protein content in the wheat plants was on the 35th day of the vegetation.

Приложения


Приложение 1


Пшеница на 14 сутки после пассажа (29.04.2008)


Рис.9. Водная экстракция гумата Рис.10. Водная экстракция гумата 0,1 г/л 0,2 г/л


Рис.11. Щелочная экстракция гумата Рис.12. Щелочная экстракция гумата 0,1 г/л 0,2 г/л


Рис.13. Коммерческий препарат гумата 0,1 г/л


Рис.14. Коммерческий препарат гумата 0,2 г/л

Приложение 2


Пшеница на 44 сутки после пассажа (29.05.2008)


Рис.15. Водная экстракция гумата Рис.16. Водная экстракция гумата 0,1 г/л 0,2 г/л


Рис.17. Щелочная экстракция гумата Рис.18. Щелочная экстракция гумата 0,1 г/л 0,2 г/л


Рис. 19. Коммерческий препарат гумата Рис. 20. Коммерческий препарат 0,1 г/л гумата 0,2 г/л

Приложение 3


Таблица 6.

Ростовые показатели растений пшеницы под влиянием экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата

Дата, сроки культивированияГуминовые кислотыОбщая масса растений пшеницы, гМасса надземной части, гполучены изконцентрация, г/л29.04.2008 14 днейВодный экстракт0,10,46±0,0270, 20±0,015Водный экстракт0,20,27±0,0150,11±0,000Щелочной экстракт0,10,21±0,0480,29±0,157Щелочной экстракт0,20,21±0,0180,12±0,012Коммерческий препарат0,10,34±0,0490,17±0,029Коммерческий препарат0,20,32±0,0280,18±0,01519.05.2008 34 дняВодный экстракт0,10,37±0,0190,26±0,027Водный экстракт0,20,39±0,0660,24±0,075Щелочной экстракт0,10,31±0,0710,17±0,035Щелочной экстракт0,20,29±0,0640, 20±0,062Коммерческий препарат0,10,42±0,0960,25±0,042Коммерческий препарат0,20,41±0,1390,30±0,039

Приложение 4


Таблица 7.

Ростовые показатели растений пшеницы под влиянием экстрактов гуминовых кислот из отработанного компоста и коммерческого препарата

Дата, сроки культивированияГуминовые кислотыОбщая масса растений пшеницы, гМасса надземной части, гполучены изконцентрация, г/л28.05.2008 43 дняВодный экстракт0,10,41±0,1050,24±0,105Водный экстракт0,20,38±0,0380,22±0,052Щелочной экстракт0,10,23±0,0250,11±0,007Щелочной экстракт0,20, 19±0,0270,13±0,02Коммерческий препарат0,10,31±0,0580,17±0,039Коммерческий препарат0,20,41±0,1410,26±0,11030.05.2008 45 днейВодный экстракт0,10,30±0,0450,21±0,035Водный экстракт0,20,29±0,0670, 19±0,044Щелочной экстракт0,10,22±0,0170,10±0,009Щелочной экстракт0,20,40±0,1380,26±0,076Коммерческий препарат0,10,54±0,1130,34±0,049Коммерческий препарат0,20,67±0,1640,40±0,122