пїњ

»Ќ“–јќѕ≈–ј÷»ќЌЌјя Ћј«≈–-»Ќƒ”÷»–ќ¬јЌЌјя ‘Ћ”ќ–≈—÷≈Ќ“Ќјя —ѕ≈ “–ќ— ќѕ»я ѕ–» Ё —ѕ≈–»ћ≈Ќ“јЋ№Ќќћ ѕјЌ –≈ј“»“≈

ќ ј–”“ёЌяЌ ј.¬., „≈–ƒјЌ÷≈¬ ƒ.¬., —јЋћ»Ќ ¬ ¬., — ќћќ–ќ’ј ƒ.ѕ., —јЋћ»Ќј ј.Ѕ.
”ƒ  616.37-002-076-073.586:615.849.19.03
»HTPAOѕEPA÷»OHHAя ЋA«EF-»Hƒ”÷»FG¬AHHAя ‘Ћ”GFE—÷EHTHAя —ѕEKTFG—KGѕ»я ѕF» ЁK—ѕEF»ћEHTAЋ№HGћ ѕAHKFEAT»TE
ј.¬. јрутюн€н, ƒ.¬. „ерданцев, ¬.¬. —алмин, ƒ.ѕ —комороха, ј.Ѕ.
—алмина
√Ѕќ” ¬ѕќ  расно€рский государственный медицинский университет им. проф. ¬.‘. ¬ойно-ясенецкого ћинздравсоцразвити€ –‘, ректор -д.м.н., проф. ».ѕ. јртюхов; кафедра и клиника хирургических болезней им. проф. ј.ћ.ƒыхно с курсом эндоскопии и эндохирургии ѕќ, зав. - д.м.н., проф. ƒ.¬. „ерданцев; кафедра биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. - д.м.н., проф. ј.Ѕ. —алмина; —ибирский федеральный университет, ректор - акад. –јЌ ≈.ј.
¬аганов; »нститут инженерной физики и радиоэлектроники, кафедра фотоники и лазерных технологий, зав. - д.ф.-м.н., профессор ¬.¬. —лабко.
–езюме. ѕредставлены результаты применени€ лазер-индуцированной флуоресцентной спектроскопии при экспериментальном панкреатите. ќбсуждаетс€ возможность использовани€ флуоресцентной визуализации и спектроскопии ткани поджелудочной железы в качестве интраоперационного экспресс-метода в диагностике некроза поджелудочной железы.
 лючевые слова: лазер-индуцированна€ флуоресценци€, оптическа€ биопси€, панкреонекроз.
јрутюн€н јлена ¬ладимировна - аспирант кафедры и клиники хирургических болезней им. проф. ј.ћ. ƒыхно с курсом эндоскопии и эндохирургии ѕќ  рас√ћ”; email: alena_aav_84@mail.ru.
„ерданцев ƒмитрий ¬ладимирович - д.м.н., проф., зав. кафедры и клиники хирургических болезней им. проф. ј.ћ. ƒыхно с курсом эндоскопии и эндохирургии ѕќ  рас√ћ”; e-mail: gs7@mail.ru.
—алмин ¬ладимир ¬алерьевич - к.ф.-м.н., доцент каф. фотоники и лазерных технологий »нститута инженерной физики и радиоэлектроники —‘”; e-mail: vsalmin@gmail.com.
јктуальное направление научных исследований в области хирургической панкреатологии - определение объема некроза поджелудочной железы в процессе хирургического вмешательства, так как именно от этого показател€ зависит т€жесть панкреатита, прогноз и дальнейша€ тактика лечени€. ¬ насто€щее врем€ существует несколько подходов к определению этого параметра: 1) визуальный осмотр
поджелудочной железы [1], однако недостатком метода €вл€етс€ сложность дифференцировки зон некроза ввиду наличи€ подкапсульных геморрагий (пропитывани€ геморрагическим выпотом тканей железы), к тому же деструктивные изменени€ даже при тотальном поражении имеют вид очагов большей или меньшей величины; 2)
ультразвуковое сканирование, которое, однако, не позвол€ет дифференцировать зону некроза и здоровую ткань [3]  “ с болюсным контрастным усилением, этот метод €вл€етс€ Ђзолотым стандартомї в диагностике [9], но его не используют интраоперационно, т.к. возможно увеличение площади некроза в ответ на введени€ контраста. ¬ св€зи с этим разработка новых методов определени€ объема некротизированной ткани поджелудочной железы в интраоперационном периоде - одно из важных направлений экспериментальной хирургии и медицинской визуализации.
¬ современной медицинской диагностике широкое распространение получили оптические методы исследовани€ живых тканей in situ, объединенные названием Ђоптическа€ биопси€ї. ѕрименение оптической биопсии, в отличие от обычной биопсии, предполагает, что ткань не извлекаетс€ и не модифицируетс€ тем или иным способом (например, дл€ гистологического исследовани€), а используетс€ та или ина€ форма оптических измерений, часто спектроскопических, выполн€емых неинвазивно или минимально инвазивно с целью поставить диагноз, на месте, in vivo и в режиме реального времени. ¬ оптической биопсии используютс€ как оптическа€ спектроскопи€ -абсорбционна€, флуоресцентна€, спектроскопи€ комбинационного рассе€ни€ света [5], так и методы медицинской оптической визуализации - оптическа€ когерентна€ томографи€, конфокальна€ лазерна€ эндомикроскопи€, эндоцитоскопи€ . ќсновное преимущество использовани€ оптической биопсии по сравнению с другими способами прижизненного исследовани€ органов и тканей заключаетс€ в высокой скорости проведени€ анализа. «ачастую результат может быть получен в режиме реального времени. ”никальным свойством оптической биопсии по сравнению с другими средствами медицинской
визуализации €вл€етс€ возможность пр€мого исследовани€ метаболических превращений в клетках живых тканей.
—реди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. ѕараметры люминесценции весьма чувствительны к состо€нию микроокружени€ флуоресцирующего агента (флуорофора), что позвол€ет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружени€, включа€ пол€рность и жесткость среды, наличие поблизости зар€дов и молекул-акцепторов энергии электронного возбуждени€. ‘луоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров -аутофлуоресценции [10]; 2) методы, использующие различные экзогенные
флуоресцирующие соединени€ - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань дл€ визуализации исследуемых процессов.   насто€щему времени накоплен значительный экспериментальный материал по использованию лазер-индуцированной
аутофлуоресцентной спектроскопии в диагностических цел€х при операционном вмешательстве в гастроэнтерологии, кардиохирургии , определены основные тканевые флуорофоры, разработаны различные прототипы установок дл€ клинического использовани€ [9, 14], предложено большое количество методик изучени€ типовых патологических процессов (ишеми€, воспаление, неоплази€, дегенеративные изменени€). Ќами ранее продемонстрирована высока€ эффективность использовани€ метода лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии в интраоперационной дифференциальной диагностике воспалени€ при перитоните [4]. ¬месте с тем, этот метод не был тестирован дл€ оценки некроза ткани in situ при остром панкреатите.
—уществуют различные флуоресцентные методы диагностики острого панкреатита. ¬озможен анализ, основанный на регистрации флуоресценции эндогенных порфиринов, и визуализации флуоресценцирующей ткани [7]. ¬озможно проведение оптической биопсии методом тримодальной системы, включающей в себ€ анализ полученных спектров флуоресценции, коэффициента отражени€ и рассе€ни€ света, что позвол€ет определить структуру и состав ткани, как in vivo, так и in vitro [8]. ћультимодальные оптические системы и методы спектроскопии производ€т спектроскопический анализ биологических тканей и классифицируют ткань поджелудочной железы, использу€ флуоресцентную, отражательную спектроскопию и спектроскопию с временным разрешением [12]. ѕрименение таких методов дает возможность реальном времени одновременно характеризовать ткань и поставить диагноз. “акие системы и методы могут использоватьс€ дл€ проведени€ биопсии во врем€ операции.
÷ель исследовани€: обосновать возможность применени€ лазер-индуцированной аутофлуоресценции дл€ объективной дифференцировки очага некроза и здоровой ткани, идентифицировать спектральные критерии дл€ прогнозировани€ течени€ острого панкреатита в эксперименте.
ћатериалы и методы
Ёксперимент проведен на беспородных кроликах-самцах массой 2,5-3,0 кг (n=30), в соответствии с этическими нормами обращени€ с животными, с разрешени€ Ѕиоэтической комиссии и Ћокального этического комитета  расно€рского государственного медицинского университета имени профессора ¬.‘. ¬ойно-ясенецкого, а также требовани€ми Ђ≈вропейской конвенции по защите позвоночных, используемых дл€ экспериментальных и иных научных целейї. ¬се кролики содержались в стандартных услови€х и на стандартном рационе вивари€.
ћоделирование острого экспериментального панкреатита осуществл€лось по методике - термокоагул€ци€ долек поджелудочной железы [6]. ѕлощадь коагул€ции составл€ла 20% от общей площади передней поверхности поджелудочной железы. ƒанна€ модель была выбрана с учетом ее максимальной приближенности к клинике острого панкреатита человека: развитие острого экспериментального панкреатита у животных сопровождаетс€ наличием всех фаз острого панкреатита, наблюдающихс€ у людей.
ќбща€ анестези€ животных обеспечивалась внутрибрюшинным введением 1% раствора тиопентала натри€ в дозе 70 мг на 1 кг массы тела. ƒл€ воспроизведени€ острого экспериментального панкреатита выполн€лась верхнесрединна€ лапаротоми€, производилась термокоагул€ци€ участка поджелудочной железы портативным термокоагул€тором —¬≈“-1, со временем экспозиции стандартно 15 секунд всем опытным животным, до образовани€ участка некроза 1,0 х 1,0 см. ѕоверхность ткани промывалась физиологическим раствором и раствором ’енкса дл€ удалени€ остатков крови и тканевой жидкости.
јутофлуоресценци€ ткани поджелудочной железы регистрировалась in situ в зоне некроза, переходной зоне и здоровой ткани, с помощью экспериментального лазерного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучени€ [14]. ƒл€ записи спектров флуоресценции использовалс€ бесконтактный метод: оптический зонд устанавливалс€ над участком исследуемой ткани размером 2х2 мм и оставалс€ неподвижным в течение периода записи спектра над каждой зоной. —пектры флуоресценции записывались in situ с нескольких участков исследуемых тканей каждого кролика в диапазоне 390-590 нм с шагом в 10 нм. ƒл€ возбуждени€ аутофлуоресценции ткани использовалось излучение ”‘
импульсного лазера на молекул€рном азоте (337,1 нм). „астота повторени€ импульсов лазерного излучени€ составила 500 √ц, энерги€ импульса - 50 мкƒж.
ƒанные измерений лазерным спектрофлуориметром представл€лись в виде двумерного массива, где ≤(у) ≥ - определ€ет номер серии эксперимента, ] - индекс длины волны. ќбработка данных включала:
ј). Ќормировку, котора€ позвол€ла сравнивать спектры, полученные в разных сери€х, и устран€ла амплитудные искажени€, вызванные различием рассто€ни€ от волоконного датчика до объекта. Ќормировка осуществл€лась делением значений интенсивности на разных участках спектра на среднее значение интенсивности, полученное по всему спектру.
к=1
Ќормированные на среднее значение спектры разносились на соответствующие три группы.
Ѕ). ¬ычисление средних нормированных спектров по группе.
Ќормированный разностный спектр вы€вл€ет наиболее значимо различные участки спектров в исследуемых выборках. ¬ качестве этих участков выбирались длины волн, соответствующие максимумам и минимумам нормированного разностного спектра.  ритерием значимости выбиралось превышение амплитуды нормированного разностного спектра на величину, большую или равную 1, что соответствовало различию между спектрами на выбранном интервале на величину, превышающую стандартное отклонение
о.
ƒокументирование изображени€ осуществл€лось с помощью цифровой фотокамеры Panasonic Lumix, в режиме длительной экспозиции в затемненном помещении при освещении излучением лазерного спектрофлуориметра при
(1)
1M
J (1 ) = ћ1 im (1 )Х
ћ m=1
(2)
где : ћ - размер выборки.
¬). Ќахождение нормированного разностного спектра
(3)
установленном на рассто€нии 0,2 м над участком ткани оптоволоконного зонда и при комнатном освещении.
—татистический анализ полученных результатов включал методы описательной статистики - определени€ среднего арифметического и стандартного отклонени€. –езультаты представлены в виде M±m, где ћ - среднее значение, m - стандартное отклонение. ƒл€ определени€ уровн€ значимости различи€ средних значений в выборках мы использовали “-тест. Ќормальность распределени€ в пределах выборки провер€ли графически с использованием функции Ќќ–ћ—“ќЅ–(–) пакета MS Excel.  оэффициент коррел€ции линейной регрессии в выборках R2>0,975.
–езультаты и обсуждение
»звестно, что т€жесть экспериментального острого панкреатита напр€мую коррелирует с интенсивностью некроза и имеет обратную зависимость от выраженности апоптоза [13].
” животных контрольной группы поджелудочна€ железа расположена позади и кнаружи от желудка, в брыжейке; она бледно-розового цвета, состоит из отдельных долек. Ќа рис. 1 представлена поджелудочна€ железа ј - при естественном освещении (неизмененна€ ткань), ¬ - при ультрафиолетовом освещении (неизмененна€ ткань), Ѕ -при естественном освещении (неизмененна€ ткань с участком некроза), √ - при ультрафиолетовом освещении визуализируетс€ участок панкреонекроза.
— помощью аутофлуоресценции при ”‘ј возбуждении четко определ€лс€ участок панкреонекроза из-за резкого снижении его аутофлуоресценции. ѕосле обнаружени€ точных границ некротизированной и здоровой ткани поджелудочной железы записывались спектры флуоресценции с разных участков.
Ќа рис. 2 представлены нормированные спектры флуоресценции
некротизированной и интактной ткани поджелудочной железы при возбуждении ”‘ лазерным излучением с длиной волны 337,1 нм. ’арактерный пик люминесценции на длине волны 465-470 нм обусловлен люминесценцией Ќјƒ(‘)Ќ, €вл€ющимс€ основным тканевым флуорофором при ”‘ј облучении. ѕоложение наиболее выраженных пиков нормированного разностного спектра представленного на рис. 3 - минимум на длине волны 470 нм, который соответствует пику люминесценции Ќјƒ(‘)Ќ, максимум на длине волны 540 нм, который соответствует пику № - полосы оксигемоглобина. ћенее выраженный пик в области 410-430 нм может быть также приписан пикам полос —оре окси- и дезоксиформ гемоглобина. “аким образом, на фоне общего снижени€ интенсивности аутофлуоресценции, вызванного уменьшением пула Ќјƒ(‘)Ќ, происходит снижение самопоглощени€ излучени€ флуоресценции на пиках полос окси- и дезоксиформ гемоглобина, что, очевидно, вызвано локальными нарушени€ми микроциркул€ции. ћы полагаем, что развитие некроза ткани поджелудочной железы ассоциировано со снижением флуоресценции Ќјƒ(‘)Ќ вследствие его свободнорадикального окислени€ в услови€х нарастающего окислительного стресса и нарушени€ регенерации пиридиновых нуклеотидов из-за развившейс€ в ткани энергетической катастрофы, обусловленной депол€ризацией мембран митохондрий и истощением ј“‘, чему способствует гипокси€, обусловленна€ микроциркул€торными изменени€ми [11].
ћы использовали отношение интенсивностей люминесценции на длинах волн 540 и 470 нм дл€ получени€ спектрального критери€, позвол€ющего дифференцировать здоровую и некротическую ткань. ¬ зоне некроза этот показатель составил 0,20±0,08, что достоверно (р<0,001) выше контрольного значени€ (0,127±0,04).
A Ѕ
–ис. 1. ѕоджелудочна€ железа в разных режимах освещени€.
–ис 2. Ќормированные спектры лазер-индуцированной аутофлуоресценции поджелудочной железы в группах норма, некроз.
–ис 3. Ќормированный разностный спектр ткани поджелудочной железы по группам норма-некроз.
“аким образом, на основании экспериментальных данных мы полагаем, что снижение интенсивности аутофлуоресценции ткани в зоне панкреонекроза по отношению к здоровой ткани €вл€етс€ критерием дл€ объективной оценки объема поражени€ поджелудочной железы при панкреонекрозе на ранних стади€х. Ётот подход перспективен дл€ разработки интраоперационного экспресс-метода оценки т€жести острого панкреатита и распространенности деструктивного процесса в железе.
INTRAOPERATIVE LASER-INDUCED FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
IN EXPERIMENTAL PANCREATITIS
A. V. Arutyunyan, D. V. Cherdantsev, V. V. Salmin,
D. P. Skomorokha, A. B. Salmina
Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voino-Yasenetsky,
Siberian Federal University
Abstract . Here are given the results of using the laser-induced fluorescence spectroscopy in experimental pancreatitis. The possibility of using fluorescence visualization and spectroscopy of pancreatic tissue as intraoperative rapid method in the diagnosis of pancreatic necrosis.
Key words: laser-induced fluorescence, optical biopsy, pancreatic necrosis.
Ћитература
1. јтанов ё. ѕ. √нойный панкреатит // ’ирурги€ - 1997. - є 8. - —. 20-24.
2. «убарев ј. ¬.,  аленова ». ¬., Ѕашилов ¬. ѕ. и др. —овременна€ ультразвукова€ диагностика объемных образований поджелудочной железы // ћедицинска€ визуализаци€. - 2001. - є 1. - —. 12-17.
3. ћинько Ѕ. ј., ѕручанский ¬. —.,  орытова Ћ. ».  омплексна€ лучева€ диагностика заболеваний поджелудочной железы. - —ѕб.: √иппократ, 2001. - 134 с.
4. —алмин ¬. ¬. —пектрофлуориметрический метод диагностики перитонита // ¬естник  рас√”. —ери€ физ.-мат. науки. - 2006. - є9. - —. 43-47.
5. “учин ¬. ¬. Ћазеры и волоконна€ оптика в биомедицинских исследовани€х. - ћ.: ‘»«ћј“Ћ»“, 2010. - 352 с.
6. Ўалимов —. ј., –адзиховский ј. ѕ.,  ейсевич Ћ. ¬.–уководство по экспериментальной хирургии. - M.: ћедицина, 1989. - 272 с.
7. Detecting and mapping of inflamed zones in a living tissue: US 6393315 B1 US: / P. M. Aprahamian, F. Heisel, A. Lucia, J. A. Miehe, M. Sowinska, M. Whelan; Issuing Organization; Google Patents - 21 May 2002; - –. 060501
8. Georgakoudi, I. Fluorescence, reflectance, and light-scattering spectroscopy for evaluating dysplasia in patients with Barrett's esophagus // Gastroenterology - 2001. - Vol. 120, 7. - P. 1620-1629.
9. Loschenov V. B. Portable spectroscopic system for fluorescent diagnostics and photodinamic therapy // Russian Chemical J. - 1998. - Vol 42, є 5. - P. 50-53.
10. Monici M., El-Gewely M. R.Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications // Biotechnology Annual Review. - 2005. - P 227-256.
11. Mukherjee R., Criddle D. N., Gukvoskaya A. Mitochondrial injury in pancreatitis // Cell Calcium. - 2008. - Vol 44, є 1. - P 14-23.
12. Multimodal Spectroscopic Systems and Methods for Classifying Biological Tissue: US 2010/0330611 A1 US: / M. A. Mycek, M. Chandra, J. Scheiman, R. H. Wilson, D. Simeone, B. McKenna, J. Purdy; Issuing Organization; Google Patents - 14 Sep 2010. - 23 р.
13. Odinokova I. V., Sung K. F., Mareninova O. A. et al. Mitochondrial mechanisms of death responses in pancreatitis // Journal of gastroenterology and hepatology. - 2008. - Vol 23, - P 2530.
14. Popov A. Y., Salmin V. V., Fursov A. A. et al. Automated laser spectrofluorimeter for monitoring of myocardial metabolism // Proc. Proceedings of SPIE, 2006. - Vol 6284. - P. 62840J.

пїњ