пїњ

¬Ћ»яЌ»≈ —ќ—“ј¬ј ѕ»“ј“≈Ћ№Ќќ… —–≈ƒџ Ќј ћ» –ќ–ј«ћЌќ∆≈Ќ»≈ Ћј¬јЌƒџ IN VITRO

”ƒ  633.81:57.085.2
¬Ћ»яЌ»≈ —ќ—“ј¬ј ѕ»“ј“≈Ћ№Ќќ… —–≈ƒџ Ќј ћ» –ќ–ј«ћЌќ∆≈Ќ»≈ Ћј¬јЌƒџ IN VITRO
©2013 Ќ.ј. ≈горова
»нститут сельского хоз€йства  рыма ЌјјЌ ”краины, г. —имферополь ѕоступила 10.06.2013
»сследовано вли€ние компонентов питательной среды ћурасиге и —куга на развитие меристемных культур лаванды (Lavandula angustifolia Mill.) на разных этапах клонального микроразмножени€ in vitro.
 лючевые слова: Lavandula angustifolia, клона.пъное микроразмножение in vitro.
Ћаванда узколистна€ (Lavandula angustifolia Mill.) €вл€етс€ одной из наиболее распространенных эфиромасличных культур, выращиваемых на юге ”краины. Ўирокое применение этого растени€ св€зано с наличием в его соцвети€х эфирного масла, кумаринов, дубильных и других веществ [7]. Ћаванда возделываетс€, главным образом, дл€ получени€ эфирного масла, которое используетс€ в пищевой и парфюмерно-косметической промышленности, в керамическом, лакокрасочном, фарфоровом производствах. ¬ медицине его примен€ют как ранозаживл€ющее, успокаивающее и спазмолитическое средство.
ѕовышение эффективности селекционной и семеноводческой работы у лаванды в значительной степени может быть достигнуто за счет внедрени€ биотехнологических приемов создани€ и размножени€ нового селекционного материала. ќдной из наиболее перспективных клеточных технологий €вл€етс€ клональное микроразмножение, которое может использоватьс€ дл€ получени€ качественного оздоровленного посадочного материала, создани€ коллекций генетической плазмы in vitro, быстрого размножени€ ценных селекционных образцов и форм, созданных с применением методов культуры тканей. ¬ литературе имеютс€ данные об исследовании отдельных вопросов, св€занных с размножением in vitro, у некоторых видов лаванды - L. officinalis, L. dentate, L. latifolia, L. angustifolia, L. viridis, L. vera, L. pedunculata, L. spica и лавандина [9-15, 17-18]. ¬ качестве эксплантов авторы чаще всего использовали меристемы из пазушных и апикальных почек [10, 12] или сегменты стебл€ с узлом [9, 11, 14, 18]. ¬ некоторых работах дл€ размножени€ примен€ли индукцию адвентивного побегообразовани€ из листьев или других органов [14, 17]. ƒл€ различных сортов и перспективных селекционных образцов L. angustifolia ранее нами была разработана методика микроразмножени€ с использованием культуры изолированных меристем [2-3].
»звестно, что, несмотр€ на широкое практическое применение технологий микроразмножени€ у многих видов растений, имеетс€ р€д проблем, сни-
≈горова Ќаталь€ јпексеевна, д.б.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией, e-mail: yegorova.na(a!mail.ru
жающих их эффективность. Ёто высока€ генотипи-ческа€ зависимость процессов морфогенеза in vitro, образование каллуса при культивировании меристем, витрификаци€ побегов, низка€ частота адаптации in vivo и другие [1, 5, 8]. ћногие из перечисленных проблем, многоэтапность и больша€ трудоемкость процесса размножени€ в культуре тканей обуславливают высокую стоимость полученных растений. ƒальнейшее совершенствование технологий размножени€ в изолированной культуре св€зано с исследовани€ми, направленными на повышение коэффициента размножени€, сокращение этапов размножени€, разработку методов культивировани€ в жидкой среде в биореакторах и других приемов. ƒостаточно важным вопросом €вл€етс€ упрощение состава питательной среды и снижение ее стоимости, что в конечном итоге будет способствовать повышению эффективности биотехнологии и понижению себестоимости пробирочных растений. ¬ св€зи с этим целью данной работы было изучение вли€ни€ различных компонентов питательной среды на развитие меристемных культур лаванды на разных этапах микроразмножени€ in vitro.
ћј“≈–»јЋ » ћ≈“ќƒџ
ћатериалом дл€ исследований служили ткани и органы лаванды узколистной {Lavandula angust'folia Mill.) сортов —тепна€, —инева и ¬дала. ¬ качестве первичных эксплантов использовали меристемы из апикальных и пазушных почек растений. ќтрезки побегов стерилизовали с использованием 70% этанола и 50% препарата ЂЅрадофенї. ѕри введении в культуру эксплантов, субкультивировании и приготовлении питательных сред примен€ли традиционные методики, прин€тые в работах по культуре ткани [4]. ¬ыделение меристем проводили под микроскопом ћЅ—-10 в услови€х ламинарного бокса. ƒл€ размножени€ на 2-м этапе полученные из почек побеги раздел€ли на микрочеренки 7-8 мм с 1 узлом и парой листьев. ѕочки или микропобеги культивировали в пробирках на различных модификаци€х питательной среды ћурасиге и —куга (ћ—) [16]. ¬ качестве регул€торов роста в среду добавл€ли кинетин ( ), гибберелло-вую кислоту (√ ), индолилмасл€ную кислоту (»ћ ) (Sigma, —Ўј). ¬ыращивание изолирован-
1601
ных культур проводили на среде с добавлением 0,7% агар-агара или на жидкой среде на мостиках из фильтровальной бумаги. ѕродолжительность цикла выращивани€ составл€ла 1-1,5 мес.  ультивирование осуществл€ли при температуре +26∞—, 70% влажности и 16-часовом фотопериоде с освещЄнностью 2-3 тыс. лк. ¬ процессе исследований определ€ли длину побегов и их число, количество узлов на побеге, частоту множественного побегообразовани€, каллусо- и ризогенеза, витрификации побегов (%).  оэффициент размножени€ (K.P.) рассчитывали как количество микрочеренков, которое можно получить за 1 цикл выращивани€, до€ этого среднее количество образующихс€ на экспланте побегов умножали на среднее число узлов на побеге. ¬се опыты проводили в 2-3-кратной повторно-сти, в каждом варианте анализировали не менее 20 эксплантов. Ёкспериментальные данные обрабатывали с помощью традиционных методов статистического анализа с использованием пакета программ Microsoft Office (Excel 2003).
–≈«”Ћ№“ј“џ » »’ ќЅ—”∆ƒ≈Ќ»≈
¬ результате проведенных нами ранее исследований было показано, что у изученных сортов лаванды при культивировании меристем из пазушных и верхушечных почек побегов необходимы 4 традиционные этапа микроразмножени€ [3]. ”становлено, что на 1-м этапе введени€ в культуру и особенно на 2-м (собственно микроразмножение), нар€ду с формированием 1-2 основных побегов, происходило активное развитие адвентивных почек и побегов. ѕодобраны питательные среды и услови€ дл€ разных этапов размножени€, обеспечивающие высокий коэффициент размножени€, частоту укоренени€ побегов (до 88%) и адаптации растений in vivo (до 97%). ѕоказано, что среды с добавлением Ѕјѕ или ауксинов индуцировали, нар€ду с множественным побегообразованием, развитие каллуса с частотой до 47-100%, а добавление в питательную среду зеатина привело к снижению основных показателей развити€ меристем. —огласно полученным нами данным, наиболее подход€щим дл€ развити€ меристемных культур лаванды на 1-2 этапах было добавление в среду MC 0,5-1,0 мг/л кинетина и 0,10,5 мг/л √ . Ќа этих средах на 2-м этапе отмечали развитие из микрочеренков основного побега длиной 20-30 мм с 4-5 узлами и до 10-14 дополнительных побегов.
ѕолученные результаты свидетельствуют о возможности использовани€ дл€ размножени€ лаванды нескольких методов - микрочеренковани€ побегов, индукции пазушных и адвентивных побегов, что позвол€ет существенно повысить коэффициент размножени€ (до 15-67 за цикл, в зависимости от генотипа и цикла размножени€). ѕри анализе особенностей морфогенеза меристемных культур L. angiistifolia было показано вли€ние сезона, генотипа и цикла микроразмножени€. ”становлено, что в течение первых трех циклов микрочеренковани€ у
всех изученных сортов и образцов происходило значительное увеличение числа дополнительных побегов, вследствие этого коэффициент размножени€ в 3-4 м циклах достигал максимального значени€ (до 35-67 у разных сортов и образцов), затем наблюдалось постепенное снижение, а после 7 цикла стабилизаци€ этого показател€.
¬ дальнейшем с целью повышени€ эффективности разработанной методики размножени€ in vitro были проведены исследовани€, направленные на упрощение состава питательной среды. ќдним из самых дорогосто€щих компонентов питательной среды €вл€етс€ агар-агар, поэтому исключение его из состава дл€ снижени€ стоимости и упрощени€ технологии микроразмножени€ €вл€етс€ весьма привлекательным.  роме того, у некоторых видов растений было показано преимущество использовани€ жидкой среды, на которой происходило более интенсивное развитие меристем по сравнению с агаризованной [6, 8]. ѕоэтому нами было проведено сравнительное исследование вли€ни€ консистенции питательной среды (жидка€ и агаризован-на€) на развитие меристемных культур лаванды сорта —тепна€ на 2 и 3-м этапах микроразмножени€ (собственно размножение и укоренение).  ак видно из представленных данных, на 2-м этапе размножени€ использование жидкой среды способствовало лучшему росту побегов и более активному адвентивному побегообразованию (табл. 1). ќднако при этом формировалось 72,3% оводненных побегов. Ќа этапе укоренени€ удаление из состава среды ћ—364 (”2 ћ—+0,5 мг/л »ћ ) агар-агара оказало более негативное воздействие. Ќа этой среде наблюдали снижение почти в 4 раза частоты укоренени€, а также ухудшение других морфометриче-ских показателей и развитие 80% витрифицирован-ных побегов. ¬ некоторых работах по микроразмножению лаванды авторы также указывали на развитие оводненных побегов, которое зависело от концентрации солей, гормонов, сахарозы и агар-агара [9, 14, 15, 18]. ѕолученные нами данные свидетельствуют о нецелесообразности использовани€ у лаванды жидких питательных сред, поскольку это, прежде всего, приводит к интенсивному формированию оводненных побегов, непригодных дл€ дальнейшего культивировани€.
— целью повышени€ эффективности технологии микроразмножени€ лаванды in vitro также была исследована возможность упрощени€ состава питательной среды ћурасиге и —куга дл€ 2-го этапа микроразмножени€ за счет снижени€ концентраций или исключени€ отдельных компонентов. ƒл€ проведени€ экспериментов предварительно были получены меристемные культуры лаванды сортов —инева, —тепна€, ¬дала. Ќа 2-м этапе размножени€ развившиес€ побеги черенковали, а микрочеренки пересаживали на питательные среды разного состава. ¬ качестве контрол€ была использована разработанна€ ранее оптимальна€ дл€ этого этапа пита-
1602
тельна€ среда ћ—418, содержаща€ 0,5 мг/л   и 0,1 мг/л √  (табл. 2).
“аблица 1. ¬ли€ние консистенции питательной среды на развитие меристемных культур лаванды сорта —тепна€ на разных этапах микроразмножени€ in vitro
Ётап размножени€ ѕитательна€ среда ƒлина побега, мм  оличество узлов, шт./ побег  оличество побегов, шт./ эксплант „астота образовани€, % „астота вит-рификации побегов, %
адвентивных побегов корней
2 ћ—418 агаризованна€ 14,5±1,0 2,2±0,2 4,2±0,6 87,5±7,2 0 0
ћ—418 жидка€ 17,2±1,2 3,2±0,3 7,9±1,0 100,0 0 72,3±6,6
3 ћ—364 агаризованна€ 19,3±1,1 4,2±0,3 1,3±0,2 0 75,0±7,8 2,9±0,3
ћ—364 жидка€ 12,7±1,0 2,4±0,2 1,9±0,3 0 18,1±2,0 80,0±7,8
“аблица 2. ¬ли€ние состава питательной среды на развитие меристемных культур лаванды сорта —тепна€ на 2-м этапе микроразмножени€
є питательной среды —остав питательной среды ƒлина побега, мм  оличество узлов, шт./побег „исло побегов, шт./ эксплант „астота множественного побегообразовани€, %  .–.
ћ—418 ћ— + (0,5 мг/л)+√  (0,1 мг/л); сахароза 2% 13,3±1,0 2,2±0,2 5,2±0,6 100,0 11,4±1,2
ћ—43 !/2 ћ— + (0,5 мг/л)+√  (0,1мг/л); сахароза 2% 12,6±0,9 2,2±0,2 4,8±0,5 100,0 10,6±1,1
ћ—44 !/2 ћ— + (0,5 мг/л)+√  (0,1мг/л); сахароза 1% 12,2±1,1 1,8±0,1 6,3±1,2 100,0 11,3±1,1
ћ—45 ћ—418; исключен инозит 12,6±1,3 2,3±0,3 4,4±1,0 87,7±7,5 10,1±0,8
ћ—46 ћ—418; исключены глицин и витамины 12,1±0,9 2,3±0,2 3,7±0,4 75,0±7,2 8,5±0,9
ћ—48 ћ—418; исключена сахароза 10,9±2,1 2,2±0,4 1,8±0,2 66,7±5,9 4,0±0,5
ћ—50 !/2 ћ— + (0,5 мг/л)+√  (0,1мг/л); сахароза 1%;никотинова€ кислота и пиридоксин - по 0,25 мг/л; тиамин - 0,05 мг/л; исключены глицин, инозит 12,3±1,1 2,3±0,3 4,6±1,0 92,3±9,1 10,6±0,9
 ак видно из представленных данных, снижение вдвое концентрации макро- и микроэлементов в питательной среде (ћ—43) или одновременное уменьшение концентрации сахарозы до 1% (ћ—44) достоверно не повли€ло на развитие побегов из микрочеренков и на коэффициент размножени€. »сключение из состава среды инозита (ћ—45), витаминов и аминокислоты глицина (ћ—46) привело к снижению до 75% частоты множественного побегообразовани€, количества побегов на эксплант и  .–., однако эти различи€ также были статистически недостоверны. ќтрицательное действие на развитие культур, особенно на способность микрочеренков к адвентивному побегообразованию, оказало исключение из состава среды сахарозы (ћ—48). ¬ этом варианте опыта  .–. снизилс€ почти в 3 раза по сравнению со средой ћ—418. –азвивающиес€ побеги были очень слабыми и имели желто-бурую окраску. » хот€ до€
формирующихс€ побегов меристемных культур свойственно автотрофное питание (в отличие от большинства гетеротрофных каллусных тканей), по-видимому, дл€ развити€ нормальных побегов и заложени€ адвентивных почек важно присутствие в среде сахарозы, как основного источника углерода. Ќа основе анализа полученных данных была разработана модификаци€ питательной среды ћ—50, в которой были вдвое снижены концентрации солей, сахарозы, витаминов и исключены инозит и глицин. “акое изменение состава среды достоверно не повли€ло на изученные морфометрические показатели - дойна и число побегов, частота множественного побегообразовани€, количество узлов и  .–. были почти такие же, как и на контрольной среде. ” сортов —инева и ¬дала были получены аналогичные данные, свидетельствующие о возможности исключени€ некоторых компонентов из состава среды ћ—. Ќа рис. представлено изменение наибо-
1603
лее важного показател€ (коэффициента размноже- при этом у "—иневы" на среде ћ—46 наблюдалось ни€) на данных модификаци€х сред у этих сортов, даже незначительное повышение K.P. до 14,9.
ћ—418 ћ—43 ћ—44 ћ—45 ћ—46 ћ—48 ћ—50
ѕитательна€ среда
–ис. ¬ли€ние состава питательной среды на коэффициент размножени€ на 2-м этапе микроразмножени€ лаванды in vitro
“аким образом, в результате проведенных исследований были вы€влены особенности вли€ни€ отдельных компонентов питательной среды на развитие меристемных культур некоторых сортов лаванды узколистной. ѕри культивировании меристем и микрочеренков нами была использована наиболее распространенна€ среда ћурасиге и —ку-га, котора€ также примен€лась многими авторами дл€ выращивани€ разных типов эксплантов лаванды с целью микроразмножени€ in vitro [10, 11, 14]. »меющиес€ литературные данные, касающиес€ гормонального состава питательных сред дл€ размножени€ видов Lavandula довольно разнообразны. “ак, у L. viridis и L. pedunculata было показано преимущество введени€ в среду Ѕјѕ [11, 18], у L. officinalis - Ѕјѕ и »”  [10], у L. dentate - Ѕјѕ и »ћ  [12], у L. vera и L. angustifolia - тидиазурона [14] или исключени€ гормонов из среды [13]. ƒл€ изученных нами сортов L. angustifolia было установлено, что оптимальной дл€ микроразмножени€ была среда MC с добавлением 0,5 мг/л кинетина и 0,1 мг/л √ . ¬о многих зарубежных работах на разных этапах размножени€ у видов лаванды использовали твердую питательную среду, содержащую от 0,7% [14] до 1% [10 ] агар-агара, и до 3-4% сахарозы [14, 15]. –€дом авторов была вы€влена необходимость снижени€ в два [10, 11] или даже четыре раза [14 ] содержани€ микро- и макроэлементов в среде MC, что способствовало уменьшению каллу-сообразовани€ и витрификации побегов. ќсобенно часто такой прием у лаванды и других растений использовалс€ дл€ укоренени€ микропобегов in vitro [5, 8, 10, 14]. ¬ отличие от проведенных дл€ разных видов лаванды исследований, наши экспериментальные данные показали не только возможность, но и целесообразность исключени€ из состава среды MC на 2-м этапе микроразмножени€ L. angustifolia отдельных компонентов (глицина, инозита) и снижени€ вдвое концентрации макро- и микроэлементов, сахарозы и витаминов. ѕредлагаема€ модификаци€ состава питательной среды
позвол€ет без существенного изменени€ основных показателей развити€ меристемных культур не только уменьшить стоимость среды и, следовательно, размноженных растений, но и в целом упростить и повысить эффективность методики кло-нального микроразмножени€ лаванды.
—ѕ»—ќ  Ћ»“≈–ј“”–џ
1. Ѕутенко –.Ѕ. Ѕиологи€ клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. ћ.: ‘Ѕ -ѕ–≈——, 1999. 160 с.
2. ≈горова Ќј. ћикроразмножение лаванды in vitro II ¬естник ’арьковского нац. аграр. ун-та. 2002. є 9 (1). —. 65-71.
3. ≈горова Ќ.ј. ѕолучение растений-регенерантов в кал-лусной культуре лаванды и их микроразмножение in vitro (метод, рекомендации). —имферополь: »ЁЋ– ”ј-јЌ, 2008. 28 с.
4.  алинин ‘.Ћ., —арнацка€ ¬.¬., ѕолищук ¬.Ѕ. ћетоды культуры тканей в физиологии и биохимии растений.  иев: Ќаукова думка, 1980. 488 с.
5.  ушшр √.ѕ., —арнацька ¬.¬. ћжроклональне розмно-женн€ рослин. Teopi€ i практика.  иев: Ќаукова думка, 2005.270 с.
6. ћитрофанова II.B. –егенераци€ in vitro микропобегов из вегетативных почек зизифуса китайского (Zizyphus jujube Mill.) и физические факторы культивировани€ // Ѕюлл. √ЌЅ—. 2003. ¬ып. 87. —. 63-66. '
7. Ќазаренко Ћ.Ѕ, јфонин ј¬. Ёфироносы юга ”краины. —имферополь: “аври€, 2008. 144 с.
8. ’асси Ѕ. –азмножение сельскохоз€йственных культур in vitro II Ѕиотехнологи€ сельскохоз€йственных растений. ћ.: јгропромиздат, 1987. —. 105-133.
9. Andrade L.B., Echewnigamy S., Era саго Ѕ. et al. Hie effect of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavander (Lavandula vera DC) // Plant Cell Tissue Org. Cult. 1999. V. 56. N2. P. 79-83.
10. Chishti N., Kaloo Z.A., Shawl A.S., Sultan Ph. Rapid in vitro clonal propagation of Lavandula officinalis chaix a multipurpose plant of industrial impotance // Pakistan J. Biol. Sciences. 2006. N9. P. 514-518.
11. Dias M.C., Almeida R., Romano A. Rapid clonal multiplication of Lavandula viridis L'Her through in vitro axillary shoot proliferation // Plant Cell Tissue Org. Cult. 2002. V. 68. N1. P. 99-102.
1604
12. Echeverrigaray S., Basso R, Andrade L.B. Micropropagation of Lavandula dental a from axillary buds of field-grown adult plants //Biol. Plantaram. 2005. V. 49. N 3. P. 439-442.
13. Ghiorghita G., Maftei D.E., Nicnta D. Some aspects concerning the in vitro reaction of Lavandula angustigolia L. // Propag. Omani. Plants. 2009. V. 9. N 1. P. 47-49.
14. Hamza A.M., OmaimaM. Abd El-Kafie, Kasem M.M. Direct micropropagation of English lavender (Lavandula angustifo-lia Munstead) plant // J. Plant Production, Mansoura Univ. 2011. V. 2. Nl.P 81-96.
15. Litcchesini M., Pacifiai S., Tognoni F. et al. Optimisation of in vitro cultural conditions of some officinal species // Acta Hort. 2006. N723. P. 6-10.
16. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15'N3. P. 473-497.
17. XianRi Li, Eun-Soo Seong, Il-Seop Kim, Chang-Yeon Yu. Micropropagation and RAPD analysis of somaclonal variants in Lavandula spica cv. Marino // Korean Jour. Med Crop Sci. 1999. V. 7. N2. P. 94-100.
18. Zuzarte M.R., Dinis A.M., Cavaleiro C. et al. Trichomes, essential oils and in vitro propagation of Lavandula peduncu-lata (Lamiaceae) // Industrial Crops and Products. 2010. N. 32. P. 580-587.
INFLUENCE OF NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION ON THE LAVENDER MICROPROPAGATION IN VITRO
©2013 N.A. Yegorova
Institute of Agriculture of Crimea of NAAS of Ukraine, Simferopol
The influence of constituents of Murashige and Skoog nutrient medium on the development of meristem cultures of lavender (Lavandula angustifolia Mill. ) on the different stages of clonal micropropagation in vitro were investigated.
Key words: Lavandula angustifolia, clonal micropropagation in vitro.
Natalia Yegorova, Doctor of Biology, senior researcher, head of laboratory, e-mail: yegorova.na(S)mail.ru
1605

пїњ